麦克雷

标题: PCR跑不出来的原因是什么？大概率是...... [打印本页]

作者: j30576851 时间: 前天 14:20
标题: PCR跑不出来的原因是什么？大概率是......
1 什么是PCR？
PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学中用于快速复制大量特定DNA片段的技术。它由Kary Mullis在1983年发明，因此他获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR的基本步骤包括三个主要阶段：变性、退火和延伸，这些步骤在一个循环过程中重复进行，以指数方式增加目标DNA的数量。
1 变性（Denaturation）：在这个阶段，双链DNA被加热至高温（通常是94°C至98°C），导致氢键断裂，使得DNA双链分离成两条单链。2 退火（Annealing）：随后，温度降低至50°C至65°C，这时短的合成寡核苷酸引物（primers）可以与目标DNA的特定区域结合。这些引物是预先设计的，它们与目标DNA片段的两端互补。3 延伸（Extension）：最后，温度再次升高至72°C，这时DNA聚合酶开始工作，沿着DNA单链合成新的互补链。由于聚合酶只能从5'到3'方向合成，所以每个新链的合成都需要一个引物。4 PCR的循环次数（cycle number）可以根据所需的DNA量来设定。通常，一个典型的PCR反应可以进行25到35个循环，每个循环都能将目标DNA的数量翻倍，理论上可以在几个小时内从单个DNA分子扩增到数十亿个分子。2 什么是引物？在PCR（聚合酶链式反应）实验中，引物（Primers）是短的、合成的单链DNA片段，它们在DNA扩增过程中扮演着至关重要的角色。引物的主要功能是为DNA聚合酶提供起始点，以确保只有目标DNA序列被精确地复制。往期引物设计方面的文章，Primer Premier5如何设计引物? 详细教程来了，引物设计 Primer Premier5操作详细过程-干货分享分分钟学会引物设计原则：1、引物长度一般在15-30碱基之间2、GC含量在40%-60%之间，扩增的片段最好也是GC含量在40%-60%之间，这样比较容易扩增；引物Tm值范围为55-65℃，上下游引物Tm值不宜相差太大，最好不要超过5度。3、引物3′端不能选择A，最好选择T4、碱基要随机分布，尤其3′端不应超过3个连续的G或C5、引物自身及引物之间不应存在互补序列，以防形成发夹结构（Hairpin）3 为什么跑不出来的原因详解？ PCR实验失败可能由多种因素导致，以下是一些常见原因的概述：1 DNA模板的质量问题：DNA降解：不当的冻融操作、非洁净的操作环境、DNA存储不当等都可能导致DNA降解。DNA纯度和浓度：不纯的DNA或DNA浓度过低都可能影响PCR扩增。2 引物设计不当：物种特异性：不同物种间的基因序列差异可能导致引物无法有效结合。设计错误：未遵循引物设计原则，如引物二聚体和发夹结构的形成。引物处理：错误的稀释或存储方法可能导致引物活性降低。3 Taq酶的选择和处理：酶活性：使用低保真度的Taq酶或多次冻融导致酶失活。酶种类：针对特定基因，可能需要高保真度的Taq酶。4 PCR仪器的性能：温度控制：仪器温度控制不准确可能导致DNA解链或延伸不充分。5 循环数设置：循环次数：对于低表达基因，可能需要增加循环数以获得足够的扩增。6 其他操作和环境因素：人为操作错误：未遵循实验操作规程，导致DNA模板、引物、试剂等出现质量问题。实验环境：实验室空气污染可能导致阴性对照出现阳性结果。

欢迎光临麦克雷 (https://mavom.cn/)