稳定CDK5，促进DRP1线粒体分裂致癌

肝细胞癌(HCC)是世界范围内癌症致死的第三大常见肿瘤，术后复发和转移是临床高致死率的痛点。临床研究识别驱动基因和阐明关键网络，可以促进发现HCC治疗的前瞻性策略。

2024年7月，南通大学郑文杰、赵辉及刘东团队共同在Cell Death Differ（IF=13.7）上，发表“Ubiquitin-specific protease 1 facilitates hepatocellular carcinoma progression by modulating mitochondrial fission and metabolic reprogramming via cyclin-dependent kinase 5 stabilization”的研究成果，揭示了泛素特异性蛋白酶1 (USP1)在肝细胞癌(HCC)进展过程中，是一个重要的促癌基因。
图形摘要：


Highlights如下：
1）USP1在HCC组织中显著升高。
2）USP1通过调节线粒体分裂增强HCC细胞的侵袭性和代谢重编程。
3）机制上，USP通过去泛素化和稳定CDK5（可被 E3 连接酶NEDD4L 降解）来增强 Drp1 Ser616 的磷酸化，诱导线粒体裂变，从而恶化 HCC 进展。
4）小分子药物ML323和Prasugrel抑制USP1功能，抑制HCC进展。临床相关性：USP1在HCC组织中高表达，与HCC患者的不良预后相关。
功能研究：USP1过表达促进体外肝癌细胞增殖（增殖和成球实验），和体内恶性增殖（斑马鱼模型、裸鼠皮下和原位成瘤模型）。相反，抑制或敲除USP1损害 HCC 细胞的表型。
机制研究：
（1）USP1可能通过诱导糖酵解促进HCC进展
为了研究其致瘤作用的潜在机制，蛋白质组学分析发现糖酵解等代谢途径中富集（图1a），TCGA数据集GSEA表明，USP1表达与糖酵解呈正相关（图1b）。细胞学实验也显示USP1促进肿瘤生长（图1c-e）。表明USP1可能通过诱导糖酵解促进HCC进展。
（2）USP1可能通过调节线粒体分裂加速HCC的进展
GO分析表明USP1与线粒体基质和线粒体相关过程的相关性（图1f），公共数据集分析也表明USP1与线粒体的活性和状态有关（图1g）。推测USP1可能会影响HCC细胞线粒体分裂融合。Drp1是与线粒体分裂相关的关键蛋白。WB检测显示，ML323（USP1抑制剂）或敲减USP1降低Drp1-S616磷酸化水平（图1h）。另外，ML323抑制或敲减USP1使线粒体呈细长状，而USP1过表达促使形成颗粒状线粒体（图1i-j），这些结果表明USP1可以促进线粒体分裂，从而加速HCC的进展（图1k）。

图1 USP1可能通过调节线粒体动力学加速HCC的进展（Ref. Fig 2/3）
（3）USP1与CDK5相互作用并去泛素化
由于USP1具有去泛素酶的功能，并在其靶蛋白上移动泛素化，假设USP1可能通过与其靶蛋白相互作用并去除泛素化来诱导上述表型。
第一步，初步确定与USP1相互作用的蛋白
通过IP-MS分析与USP1互作的蛋白分子（图2a），同时参考UbiBrowser预测的USP1底物中，筛选出USP1的6个候选蛋白。其中，CDK5与线粒体功能障碍和肝癌发生相关。表达相关性检测显示，敲低或抑制USP1降低CDK5蛋白水平（图2b），而不引起CDK5 mRNA的变化（图2c），表明USP1在翻译后水平调控了CDK5蛋白的丰度。
第二步，USP1可以与CDK5相互作用
RosettaDock预测分析显示USP1可与CDK5互作（图2d）。内、外源Co-IP实验发现USP1与CDK5互作（图2e-f）。GST pulldown实验显示USP1与CDK5相互作用（图2g）。
第三步，确定USP1上哪个结构域对与CDK5相互作用
构建三个USP1截断突变体(TMs)，USP1-TM1(1-400 aa)，USP1-TM2 (401-785 aa)和USP1-TM3 (201-785 aa)，Co-IP分析显示，WT、TM2和TM3可与CDK5互作，而TM1不能与CDK5互作（图2h-i），表明USP1的c端(401-785 aa)主要负责与CDK5的相互作用。
第四步，USP1与CDK5互作，使CDK5去泛素化
WB检测显示，抑制或敲减USP1促进CHX诱导的CDK5蛋白降解，而野生型USP1则延长了CDK5蛋白的半衰期，失活突变体USP1-C90S则无此功能（图2j）。另外，蛋白酶体抑制剂MG132显著拯救了USP1敲低或抑制剂抑制的CDK5（图2k-l）。进一步Co-IP实验发现，抑制或敲减USP1显著诱导CDK5的泛素化（图2m-n）。与此同时，与WT相比，突变失活体USP1-C90S失去了去泛素化CDK5的能力（图2o）。与泛素K63相比，抑制或敲低USP1可促进K48连接的CDK5泛素化（图3p-q）。这些结果表明，USP1具有特异性地去除CDK5的泛素化修饰，具有稳定CDK5蛋白的功能。


图2 USP1与CDK5相互作用并使其去泛素化（Ref. Fig 4/S3）
（4）USP1通过稳定CDK5蛋白，促进DRP1-S616磷酸化介导的线粒体分裂
为了探究CDK5是否介导USP1诱导的线粒体分裂，挽救实验显示CDK5过表达挽救USP1缺失对DRP1-S616处磷酸化水平的影响，CDK5激酶失活突变体D144N功能丧失（图3a）。另外，使用CDK5抑制剂Roscovitine消除了USP1诱导的Drp1在S616位点的磷酸化（图3a）。进一步，CDK5过表达挽救了USP1缺失对糖酵解表型和糖酵解酶表达的影响以及肿瘤生长，而激酶失活突变体D144N则无此功能（图3b-c）。表明USP1通过稳定CDK5蛋白，进一步上调DRP1-S616位点的磷酸化，促进HCC细胞线粒体分裂。
（5）USP1通过中断NEDD4L介导的泛素化来稳定CDK5
CDK5是USP1促癌的关键节点，USP1是CDK5的去泛素化酶，USP1如何打破CDK5的泛素修饰促进CDK5蛋白的稳定性，需要探究CDK5的泛素化修饰机制。
第一步，筛选与USP1合作调节CDK5稳定性的E3连接酶
结合UbiBrowser和HitPredict分析表明NEDD4L和STUB1是CDK5潜在的E3连接酶（图3d）。Co-IP分析发现，与STUB1相比，NEDD4L可以与CDK5显著相互作用，在蛋白水平上降低CDK5的表达，但对其mRNA水平无显著影响（图3e-g）。
第二步，NEDD4L参与CDK5稳定性调控
NEDD4L过表达加速了CHX诱导的CDK5降解，而USP1进一步阻碍了NEDD4L介导的CDK5降解；相反，NEDD4L的过表达或敲低显著降低或增强CDK5蛋白的稳定性（图3h）。Co-IP实验显示，野生型NEDD4L显著降低了CDK5的表达，诱导了CDK5上K48连接的泛素化，而其激酶失活突变体C942S对CDK5蛋白水平没有显著影响（图3i-j）。
第三步，确定USP1与NEDD4L竞争结合CDK5，其中USP1优势结合。
Co-IP分析发现，USP1过表达或敲低显著抑制或增强了NEDD4L/CDK5之间的相互作用；ML323抑制USP1，对NEDD4L/CDK5的相互作用没有显著影响（图3k-m）。此外，在NEDD4L缺失的细胞中，ML323诱导的泛素化变化较少（图3n）。USP1的过表达或敲低显著降低或增强NEDD4L介导的CDK5泛素化，而在ML323处理组中未观察到显著变化（图3o-q）。WB检测显示，NEDD4L负向调节Drp1的表达水平(S616)，而通过USP1或CDK5过表达恢复Drp1的表达水平（图3r）。此外，功能回复实验显示，过表达USP1可以挽救侵袭性表型（图3s-t）。表明USP1/NEDD4L可以调节HCC细胞中CDK5的稳定。

图3 USP1和NEDD4L平衡CDK5的去泛素化和泛素化（Ref. Fig 6）
结论：该研究发现USP1在HCC表达水平升高，与不良预后正相关。功能上，USP1在体内外促进HCC进展；抑制或敲减USP1，则表型受到抑制。机制上，高表达的USP1通过竞争性优势结合CDK5，使其去泛素化和稳定来增强Drp1在Ser616位点的磷酸化，从而诱导线粒体分裂，诱导恶性表型和代谢重编程，从而恶化HCC进展。